激素对魔芋球茎愈伤组织诱导和植株再生的影响

   以魔芋球茎为外植体,采用附加不同种类和浓度的生长素、细胞分裂素的MS培养基,研究激素对魔芋愈伤组织诱导、生长和分化的影响。结果表明在适量的生长素配合作用下,6-BA浓度为1.5 mg/L,有利于球茎愈伤组织诱导增殖,浓度增加为2.0 mg/L,则有利于芽的分化;6-BA浓度一定时,生长素浓度较高,愈伤长势旺盛,但分化出苗较慢,生长素浓度偏低,愈伤增殖较慢,但芽分化较快。分析了不同种类激素的作用效果,认为适合花魔芋球茎植株再生的最适培养基是MS+6-BA 1.5~2.0 mg/L+NAA 0.1~0.5 mg/L。 
  关键词 魔芋;球茎;组织培养;激素 
  中图分类号 S632.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2014)22-0067-02 
  Effect of Hormone on Callus Induction and Plant Regeneration from Corm Explants of Amorphophallus konjac 
  XU Xiao-yan TANG Wan-xiang QIN Qian-jin YANG Wen-zhi 
  (Yichang Institute of Agricultural Science in Hubei Province,Yichang Hubei 443004) 
  Abstract In order to study the effects of hormone on tissue culture of Amorphophallus konjac,the corm was used as explants for callus induction,bud differentiation and plant regeneration on MS medium with various hormone combinations.It showed that conspired by adequate auxin,the optimum concentration of 6-BA(kinin)for callus induction was 1.5 mg/L and 2.0 mg/L for bud differentiation.When cultured on medium supplemented with definite concentration 6-BA,the callus grew rapidly and bud differentiated slowly with higher auxin;and the callus grew slowly meanwhile bud differentiated easily with lower auxin.The effects of different growth regulators were discussed in the paper and it was considered that the suitable medium was MS+6-BA 1.5~2.0 mg/L+NAA 0.1~0.5 mg/L. 
  Key words Amorphophallus konjac;corm;tissue culture;phytohormones 
  魔芋为天南星科魔芋属多年生草本植物,生产上主通过根状茎、球茎进行无性繁殖,繁殖系数较低。用种量大,种源缺乏,是魔芋生产发展和新品种迅速推广的主制约因素之一。组培快繁是解决魔芋生产中用种量大、自然繁殖率低的有效途径。近年来,针对魔芋组织培养技术的研究很多1-2,有关激素对魔芋愈伤组织诱导和植株再生的影响,不同的研究者所得结果有一定差异,主解释是魔芋品种不同,其愈伤组织诱导和分化条件有差异。该文在前人研究的基础上,用球茎作外植体,选用添加不同种类和浓度激素的MS培养基,研究自育魔芋新品系M26的最佳诱导培养基,为进一步完善魔芋组培技术以及M26的组培扩繁提供依据。 
  1 材料与方法 
  1.1 试验材料 
  试验材料为花魔芋新品系M26球茎。 
  1.2 愈伤组织诱导和增殖培养 
  球茎用自来水冲洗干净后晾干,在无菌操作台内去皮,切成较大的组织块,放在75%酒精中浸泡1 min,转入0.1% HgCl2中进行表面消毒12 min,用无菌水冲洗3次,切成1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的小块(每块约重0.5 g),接种在8种不同的诱导培养基上(表1,MS基本培养基附加不同的激素组合,pH值6.0,蔗糖浓度30 g/L,琼脂7.8 g/L,每瓶培养基容量为30 mL)。每处理接种12瓶,每瓶5个外植体,3次重复。外植体接种后在25 ℃室温的电热培养箱中暗培养30 d后,不切割转接到相同的新鲜培养基上继代增殖。培养20 d时调查愈伤诱导率,60 d时调查芽分化率和愈伤块重。 
  1.3 芽点分化培养 
  将上述不同培养基上诱导形成的愈伤组织切割成0.5 cm见方的小块,转入MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的统一分化培养基中,进行愈伤组织继代和芽点分化培养。培养温度(25±2)℃,光照时间12 h,光照强度1 500~2 000 lx,培养30 d时调查不定芽诱导率、无效愈伤百分率(愈伤组织在继代培养过程中褐变死亡或呈水渍状萎缩不生长的愈伤,该文通称为无效愈伤)。 
  1.4 再生植株的培养及生根 
  将继代分化培养中形成的不定芽带一定愈伤组织切割转入壮苗生根培养基1/2 MS+IBA 0.05 mg/L上培养,培养温度(25±2)℃,光照时间12 h,光照强度1 500~2 000 lx。未形成不定芽的愈伤组织切割后在新鲜分化培养基上继续分化培养。
  2 结果与分析 
  2.1 愈伤组织诱导和生长 
  从表1可以看出,8种不同配方均能诱导愈伤形成,多数外植体接种1周后开始增厚,20 d在切口表面形成一层很薄的白色愈伤组织,并不断增殖,逐渐膨大呈瘤状,颜色也不断加深,一般位于外植体上部的愈伤为淡黄色或粉红色,靠近培养基底部的愈伤为棕红色。不同配方的愈伤诱导率不同。8种培养基中,MS8、MS5、MS4、MS3诱导率均高达95%以上,显著高于其他4种配方;其次是MS6和MS7,分别为84.0%和81.4%;MS1和MS2较低,分别为67.5%和72.8%。 
  愈伤组织在原诱导培养基上均可以生长增殖,但不同培养基上愈伤组织生长速度并不一致。培养60 d后,外植体的重量由初次接种的0.5 g增加到1.2~2.0 g,重量增加了1~3倍。MS5、MS6、MS7等培养基增殖较快,显著优于其他培养基,其中增殖最快的是MS5,可能是加入了2,4-D的缘故。 
  在6-BA浓度为1.5 mg/L的培养基中,球茎愈伤诱导率普遍较高,增殖较快,说明采用该浓度有利于魔芋球茎愈伤组织的诱导和增殖,这一结果与陈永波等3的研究结果一致。 
  2.2 不同诱导培养基形成的愈伤组织分化能力比较 
  将诱导培养基上得到的愈伤组织转入到统一的分化培养基上进行分化培养,部分愈伤组织继续增殖,并继续分化形成不定芽或根;部分愈伤组织只增殖,未见芽点分化出现;还有部分愈伤组织褐化坏死或停止生长。从表2可以看出,MS2、MS3、MS7、MS8等配方芽分化早,接种60 d后即有少量芽点出现;MS6则过早出现根器官,说明培养基中的NAA浓度过高;MS4、MS5、MS6等6-BA浓度为1.5 mg/L的培养基上形成的愈伤在分化培养中长势旺盛,褐变轻,但分化速度较慢,分化率偏低;MS7、MS8等6-BA浓度为2.0 mg/L的培养基,其愈伤组织增殖相对较慢,但分化快,分化率高,同时培养基褐变较重,可添加PVP控制褐变。 
  总之,该试验球茎愈伤组织诱导培养基设置是在前人研究基础上进行的,各配方均能较好地诱导愈伤形成,但采用不同配方愈伤生长速度不同,器官形成和分化能力也各异。总体来说,在适当浓度的生长素配合作用下,6-BA的浓度为1.5 mg/L时,有利于愈伤的诱导和增殖;6-BA的浓度为2.0 mg/L时,所形成的愈伤组织芽分化能力最强。笔者认为,在该实验室条件下,MS3、MS4、MS5是球茎愈伤组织最佳诱导培养基,既能保证一定的愈伤增殖率,又可加快出苗速度。在实际应用中,可灵活选用激素浓度和配比,如侧重扩繁,可选用MS5作球茎愈伤组织诱导培养基;侧重快繁时,可选用MS7培养基。 
  3 结论与讨论 
  3.1 激素种类和浓度对愈伤组织诱导、生长和分化的影响 
  植物的生长发育是由生长素和细胞分裂素的相互作用控制的。在植物组织培养过程中,生长素主作用是诱导刺激细胞分裂和根的分化,而细胞分裂素的主作用是刺激细胞分裂,诱导芽的分化,抑制根的生长,它们的用量取决于植物组织的内源激素水平。孙远朋的研究结果表明,球茎中细胞分裂素变化比顶芽小,但含量较低4,因此需在培养基中添加补充。该试验研究表明,在适量的生长素配合作用下,6-BA浓度为1.5 mg/L,有利于球茎愈伤组织诱导、增殖,浓度增加为2.0 mg/L时,则有利于芽的分化。 
  黄丹枫等5研究结果表明,魔芋球茎中IAA含量很低,细胞脱分化、愈伤组织形成所需IAA主来源于培养基,在不含生长素的培养基中,愈伤组织的形成和生长虽可依靠自身的IAA合成代谢,但生长量和分化潜力显著受阻。该试验也证实了这一点,在培养基中添加一定量的NAA、IAA、IBA、2,4-D等生长素,与适量的细胞分裂素配合使用,均能诱导球茎愈伤形成和增殖,但不同的生长素作用效果不一样。IAA见光易分解,用量应稍高,在1.0~1.5 mg/L比较适宜。2,4-D是诱导愈伤组织最有效的物质,在扩繁增殖中使用低浓度的2,4-D,能促进愈伤迅速增殖;但2,4-D同时也是一种有效的器官发生抑制剂,而且它的后效持久6,使用浓度必须低,在求快繁时最好不用。NAA性质较稳定,价格实惠,是最便宜和有效的生长素,其适用浓度在0.1~1.0 mg/L(超过1.0 mg/L则会使根过早分化,不利于出苗),在此范围内,使用浓度较高,愈伤长势旺盛,增殖率高,但分化出苗较慢;使用浓度较低,则愈伤增殖较慢,但芽分化相对较快。 
  3.2 激素配比对球茎愈伤组织诱导、生长和分化的影响 
  Skoog和Miller认为,植物再生过程中器官形成是由于生长素和细胞分裂素相互之间的比例所决定的,而不是由这些物质的绝对浓度决定。一般认为,细胞分裂素/生长素比例较高时,可能分化出芽;比例较低时,则可能分化出根7。在魔芋球茎愈伤组织诱导增殖过程中,6-BA/NAA=1.5/0.15,接种60 d后即有芽点分化出现;6-BA/NAA=1.5/1.5时,出现根分化;BA/NAA=1.5/0.5时,未见器官分化出现。为了保证先出芽再生根,笔者认为在魔芋球茎愈伤组织诱导和植株再生过程中,6-BA适宜浓度为1.5~2.0 mg/L,NAA的浓度为0.1~0.5 mg/L为佳。在此范围内诱导阶段两者比值宜小,可提高愈伤增殖率;分化阶段宜大,有利于快速出苗。 
  3.3 根的分化与生长 
  魔芋不定芽分化形成后,对激素的种类和求不敏感,因此有的研究者提出“一步成苗法”,即不按常规方法另外配制生根培养基,而是按20~30 d继代1次的频率,将不定芽带一定愈伤组织分割后仍在原来的继代分化培养基上培养,愈伤组织增殖、再分化、不定芽壮苗生根同时进行8。笔者认为在实际生产中,还是采用生根培养基进行壮苗生根培养更能节省成本,便于批量化生产。 
  4 参考文献 
  1 苏承刚,张兴国,张盛林.桂平魔芋组织培养研究J.西南农业大学学报,1999,8(1)76-80. 
  2 柳俊,谢从,余展深,等.魔芋离体繁殖研究J.华中农业大学学报,2001,23(3)228-229. 
  3 陈永波,赵清华,腾建勋,等.正交试验优化花魔芋组织培养条件J.氨基酸和生物资源,2005,27(2)29-30. 
  4 刘佩英.魔芋学M.北京中国农业出版社,2004213-215. 
  5 黄丹枫,陆文初.细胞分裂素与魔芋组织培养器官发生研究J.西南农业大学学报,1993,15(6)522-526. 
  6 李浚明.植物组织培养教程M.北京中国农业大学出版社,20004-11. 
  7 崔德才,徐培文.植物组织培养与工厂化育苗M.北京化学工业出版社,200327-30. 
  8 王玲,李永军,房亚南,等.魔芋组织培养的一步成苗技术研究J.西南农业学报,2004,17(5)636-638.